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    張老師

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    RNA m6A甲基化測序MeRIP-seq

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    N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。
    產(chǎn)品介紹

    N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。m6A功能非常豐富,包括調節RNA的剪接、核輸出、穩定性和翻譯來(lái)影響RNA的命運和表達,也因此成為近年來(lái)國內外的研究熱點(diǎn),國自然的研究數目屢屢攀高。為了滿(mǎn)足廣大科研工作者的需求,艾斯基因推出微量以及常量m6A甲基化免疫沉淀測序(m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing,m6A MeRIP-seq),在全基因組范圍內鑒定具有m6A修飾的區域。其原理為通過(guò)特異識別m6A修飾的抗體,對細胞內具有m6A修飾的RNA?段進(jìn)?免疫共沉淀。對沉淀下來(lái)的RNA?段進(jìn)??通量測序,結合?物信息學(xué)分析,對樣本m6A修飾進(jìn)?系統研究。MeRIP-seq是?前研究m6A修飾使?較普遍的技術(shù)之?。

    重要技術(shù)質(zhì)控,用心服務(wù)每一個(gè)項目

    艾斯團隊專(zhuān)注表觀(guān)組學(xué)12年,提供表觀(guān)多組學(xué)完整解決方案;

    每年服務(wù)100+海外和國內企業(yè)及200+高校和醫院等客戶(hù);

    已經(jīng)完成人、動(dòng)植物等幾十個(gè)物種, 5000+例樣本項目;

    嚴格m6A MeRIP建庫質(zhì)控和效率;

    自動(dòng)化樣本處理、建庫及分析流程,保障高效周期,40天極速交付;

    團隊已經(jīng)發(fā)表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章;

    專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊, 提供更多個(gè)性化分析思路和方案

    樣品類(lèi)型和要求

    樣本類(lèi)型

    樣本要求

    Total RNA

    提供去蛋白并進(jìn)行DNase處理后的完整Total RNA,樣本總量不小于20 ug,樣品濃度不低于100 ng/uL。

    培養細胞

    提供不少于1x10*7個(gè)細胞,收集貼壁或者懸浮細胞、用PBS(RNase-free)洗滌1次,加入1mL Trizol反復吹打細胞至看不見(jiàn)成團的細胞塊,整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài);液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸。

    新鮮動(dòng)物組織

    提供切成1cm2左右的組織塊,不少于2g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸;皮膚、骨、結締組織、脂肪等特殊組織建議送備份

    新鮮植物組織

    提供切成1cm2左右的組織塊,不少于5g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸

    其他類(lèi)型樣本

    咨詢(xún)技術(shù)支持

    備注:用封口膜密封樣品; 干冰運輸;送樣前備注好物種、部位、保存時(shí)間

    數據信息分析

    DRS

    分析內容

    備注

    標準分析

    1、測序數據質(zhì)量評估

    過(guò)濾掉低質(zhì)量數據,保證數據質(zhì)量

    2、參考序列比對分析

    比對率和覆蓋度分析

    3、m6A Peak Calling

    鑒定具有m6A修飾的區域

    4、m6A Peak motif

    m6A修飾區域的序列偏好性

    5、m6A Peak圖譜分布

    m6A修飾在轉錄組上的分布

    6、差異m6A Peak分析

    分析不同樣本間差異Peak峰

    7、差異m6A Peak富集

    差異Peak峰的GO富集、KEGG富集分析

    高級分析

    8、多組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析

    與基因組,轉錄組,代謝組等數據關(guān)聯(lián)分析

    9、關(guān)聯(lián)臨床信息分析

    結合樣本臨床信息進(jìn)行統計分析挖掘

    10、其它定制化分析

    結合課題背景亮點(diǎn)挖掘

    案例1 去甲基化酶ALKBH5通過(guò)PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌的侵襲

    Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer 21, 34 (2022) (IF=41.44)

    研究方案:胃癌是嚴重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。胃癌轉移是癌癥治療失敗的主要原因之一,但N6 -甲基腺苷(m6A)與胃癌轉移的相關(guān)性報道較少。本研究采用Merip-seq檢測胃癌組織和正常組織(各三個(gè)重復)中的m6A修飾變化,qRT-PCR和IHC檢測ALKBH5在胃癌組織和細胞系中的表達,聯(lián)合RNA-seq和MeRIP-qRT-PCR技術(shù)篩選ALKBH5靶基因,后使用RNA Pull Down、質(zhì)譜法和Merip-seq篩選靶基因的“reader調控蛋白”。

    研究亮點(diǎn):關(guān)聯(lián)m6A和基因表達,鑒定ALKBH5靶基因及靶基因的調控蛋白

    研究結果:1.胃癌組織中檢測到ALKBH5表達降低,去甲基酶ALKBH5干擾促進(jìn)胃癌細胞轉移。2.鑒定PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點(diǎn),促進(jìn)了GC的侵襲和遷移。3.由ALKBH5敲低或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調表明ALKBH5以m6a依賴(lài)的方式調節PKMYT1的表達。4.IGF2BP3通過(guò)其m6A修飾位點(diǎn)幫助穩定PKMYT1的mRNA穩定性

    圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細胞粘附相關(guān),ALKBH5與胃癌預后相關(guān)

    案例2 番茄果實(shí)膨脹過(guò)程中mRNA m6A甲基組的獨特特征

    Unique features of mRNA m6 A methylomes during expansion of tomato (Solanum lycopersicum) fruits

    研究方案:盡管m6A在胚胎發(fā)育、花期控制、小孢子產(chǎn)生、果實(shí)成熟和逆境響應等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,但其在植物發(fā)育其他方面的作用仍有待探索。該研究通過(guò)平行的m6A免疫沉淀測序(m6A-seq)和RNA-seq分析,揭示了m6 A沉積與番茄果實(shí)膨脹之間的潛在聯(lián)系,鑒定番茄果實(shí)從未成熟綠期向成熟綠期擴展的過(guò)程中的m6A水平和基因表達之間的關(guān)系。

    研究亮點(diǎn):多組學(xué)聯(lián)合分析,兩種抑制劑處理,關(guān)聯(lián)表型

    研究結果:1.開(kāi)花后12,20,28天的番茄果實(shí)中全RNA和mRNA的m6A甲基化程度的逐步提升,分別檢測到15720、16547和16381個(gè)m6A Peak。2.大量參與生長(cháng)素和赤霉素信號傳導基因,以及一些與細胞擴增和果皮厚度相關(guān)的基因都含有m6A修飾。3.m6A甲基化轉移酶抑制劑DA的注射降低m6A水平,加速果實(shí)成熟;去甲基化酶抑制劑MA的注射則延緩果實(shí)成熟。


    圖二 直接注射m6A轉移酶抑制劑或去甲基化酶抑制劑對番茄果實(shí)發(fā)育的影響

    常見(jiàn)問(wèn)題

    1. 為什么MeRIP-seq需要測兩個(gè)樣本(Input和IP)?

    常規m6A MeRIP-seq中Input和IP構成一對組合。IP樣品使用m6A抗體特異性富集具有甲基化修飾的RNA,而Input則是僅含有RNA的對照,通過(guò)消除背景噪音和峰值PEAK計算,將兩個(gè)樣本不同m6A區域計算出來(lái)。

    2. MeRIP-seq后續的實(shí)驗怎么安排?

    在利用MeRIP-seq得到m6A甲基化差異基因后,下一步可以通過(guò)MeRIP-qPCR直接對該基因進(jìn)行驗證。也可以通過(guò)關(guān)聯(lián)多組學(xué)(比如RNA-seq)分析基因表達和m6A修飾的變化,從多方面挖掘分析內容。

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    N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。
    0755-28507994
    產(chǎn)品介紹

    N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。m6A功能非常豐富,包括調節RNA的剪接、核輸出、穩定性和翻譯來(lái)影響RNA的命運和表達,也因此成為近年來(lái)國內外的研究熱點(diǎn),國自然的研究數目屢屢攀高。為了滿(mǎn)足廣大科研工作者的需求,艾斯基因推出微量以及常量m6A甲基化免疫沉淀測序(m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing,m6A MeRIP-seq),在全基因組范圍內鑒定具有m6A修飾的區域。其原理為通過(guò)特異識別m6A修飾的抗體,對細胞內具有m6A修飾的RNA?段進(jìn)?免疫共沉淀。對沉淀下來(lái)的RNA?段進(jìn)??通量測序,結合?物信息學(xué)分析,對樣本m6A修飾進(jìn)?系統研究。MeRIP-seq是?前研究m6A修飾使?較普遍的技術(shù)之?。

    重要技術(shù)質(zhì)控,用心服務(wù)每一個(gè)項目

    艾斯團隊專(zhuān)注表觀(guān)組學(xué)12年,提供表觀(guān)多組學(xué)完整解決方案;

    每年服務(wù)100+海外和國內企業(yè)及200+高校和醫院等客戶(hù);

    已經(jīng)完成人、動(dòng)植物等幾十個(gè)物種, 5000+例樣本項目;

    嚴格m6A MeRIP建庫質(zhì)控和效率;

    自動(dòng)化樣本處理、建庫及分析流程,保障高效周期,40天極速交付;

    團隊已經(jīng)發(fā)表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章;

    專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊, 提供更多個(gè)性化分析思路和方案

    樣品類(lèi)型和要求

    樣本類(lèi)型

    樣本要求

    Total RNA

    提供去蛋白并進(jìn)行DNase處理后的完整Total RNA,樣本總量不小于20 ug,樣品濃度不低于100 ng/uL。

    培養細胞

    提供不少于1x10*7個(gè)細胞,收集貼壁或者懸浮細胞、用PBS(RNase-free)洗滌1次,加入1mL Trizol反復吹打細胞至看不見(jiàn)成團的細胞塊,整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài);液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸。

    新鮮動(dòng)物組織

    提供切成1cm2左右的組織塊,不少于2g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸;皮膚、骨、結締組織、脂肪等特殊組織建議送備份

    新鮮植物組織

    提供切成1cm2左右的組織塊,不少于5g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸

    其他類(lèi)型樣本

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    備注:用封口膜密封樣品; 干冰運輸;送樣前備注好物種、部位、保存時(shí)間

    數據信息分析

    DRS

    分析內容

    備注

    標準分析

    1、測序數據質(zhì)量評估

    過(guò)濾掉低質(zhì)量數據,保證數據質(zhì)量

    2、參考序列比對分析

    比對率和覆蓋度分析

    3、m6A Peak Calling

    鑒定具有m6A修飾的區域

    4、m6A Peak motif

    m6A修飾區域的序列偏好性

    5、m6A Peak圖譜分布

    m6A修飾在轉錄組上的分布

    6、差異m6A Peak分析

    分析不同樣本間差異Peak峰

    7、差異m6A Peak富集

    差異Peak峰的GO富集、KEGG富集分析

    高級分析

    8、多組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析

    與基因組,轉錄組,代謝組等數據關(guān)聯(lián)分析

    9、關(guān)聯(lián)臨床信息分析

    結合樣本臨床信息進(jìn)行統計分析挖掘

    10、其它定制化分析

    結合課題背景亮點(diǎn)挖掘

    案例1 去甲基化酶ALKBH5通過(guò)PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌的侵襲

    Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer 21, 34 (2022) (IF=41.44)

    研究方案:胃癌是嚴重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。胃癌轉移是癌癥治療失敗的主要原因之一,但N6 -甲基腺苷(m6A)與胃癌轉移的相關(guān)性報道較少。本研究采用Merip-seq檢測胃癌組織和正常組織(各三個(gè)重復)中的m6A修飾變化,qRT-PCR和IHC檢測ALKBH5在胃癌組織和細胞系中的表達,聯(lián)合RNA-seq和MeRIP-qRT-PCR技術(shù)篩選ALKBH5靶基因,后使用RNA Pull Down、質(zhì)譜法和Merip-seq篩選靶基因的“reader調控蛋白”。

    研究亮點(diǎn):關(guān)聯(lián)m6A和基因表達,鑒定ALKBH5靶基因及靶基因的調控蛋白

    研究結果:1.胃癌組織中檢測到ALKBH5表達降低,去甲基酶ALKBH5干擾促進(jìn)胃癌細胞轉移。2.鑒定PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點(diǎn),促進(jìn)了GC的侵襲和遷移。3.由ALKBH5敲低或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調表明ALKBH5以m6a依賴(lài)的方式調節PKMYT1的表達。4.IGF2BP3通過(guò)其m6A修飾位點(diǎn)幫助穩定PKMYT1的mRNA穩定性

    圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細胞粘附相關(guān),ALKBH5與胃癌預后相關(guān)

    案例2 番茄果實(shí)膨脹過(guò)程中mRNA m6A甲基組的獨特特征

    Unique features of mRNA m6 A methylomes during expansion of tomato (Solanum lycopersicum) fruits

    研究方案:盡管m6A在胚胎發(fā)育、花期控制、小孢子產(chǎn)生、果實(shí)成熟和逆境響應等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,但其在植物發(fā)育其他方面的作用仍有待探索。該研究通過(guò)平行的m6A免疫沉淀測序(m6A-seq)和RNA-seq分析,揭示了m6 A沉積與番茄果實(shí)膨脹之間的潛在聯(lián)系,鑒定番茄果實(shí)從未成熟綠期向成熟綠期擴展的過(guò)程中的m6A水平和基因表達之間的關(guān)系。

    研究亮點(diǎn):多組學(xué)聯(lián)合分析,兩種抑制劑處理,關(guān)聯(lián)表型

    研究結果:1.開(kāi)花后12,20,28天的番茄果實(shí)中全RNA和mRNA的m6A甲基化程度的逐步提升,分別檢測到15720、16547和16381個(gè)m6A Peak。2.大量參與生長(cháng)素和赤霉素信號傳導基因,以及一些與細胞擴增和果皮厚度相關(guān)的基因都含有m6A修飾。3.m6A甲基化轉移酶抑制劑DA的注射降低m6A水平,加速果實(shí)成熟;去甲基化酶抑制劑MA的注射則延緩果實(shí)成熟。


    圖二 直接注射m6A轉移酶抑制劑或去甲基化酶抑制劑對番茄果實(shí)發(fā)育的影響

    常見(jiàn)問(wèn)題

    1. 為什么MeRIP-seq需要測兩個(gè)樣本(Input和IP)?

    常規m6A MeRIP-seq中Input和IP構成一對組合。IP樣品使用m6A抗體特異性富集具有甲基化修飾的RNA,而Input則是僅含有RNA的對照,通過(guò)消除背景噪音和峰值PEAK計算,將兩個(gè)樣本不同m6A區域計算出來(lái)。

    2. MeRIP-seq后續的實(shí)驗怎么安排?

    在利用MeRIP-seq得到m6A甲基化差異基因后,下一步可以通過(guò)MeRIP-qPCR直接對該基因進(jìn)行驗證。也可以通過(guò)關(guān)聯(lián)多組學(xué)(比如RNA-seq)分析基因表達和m6A修飾的變化,從多方面挖掘分析內容。

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