N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。m6A功能非常豐富,包括調節RNA的剪接、核輸出、穩定性和翻譯來(lái)影響RNA的命運和表達,也因此成為近年來(lái)國內外的研究熱點(diǎn),國自然的研究數目屢屢攀高。為了滿(mǎn)足廣大科研工作者的需求,艾斯基因推出微量以及常量m6A甲基化免疫沉淀測序(m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing,m6A MeRIP-seq),在全基因組范圍內鑒定具有m6A修飾的區域。其原理為通過(guò)特異識別m6A修飾的抗體,對細胞內具有m6A修飾的RNA?段進(jìn)?免疫共沉淀。對沉淀下來(lái)的RNA?段進(jìn)??通量測序,結合?物信息學(xué)分析,對樣本m6A修飾進(jìn)?系統研究。MeRIP-seq是?前研究m6A修飾使?較普遍的技術(shù)之?。
重要技術(shù)質(zhì)控,用心服務(wù)每一個(gè)項目
艾斯團隊專(zhuān)注表觀(guān)組學(xué)12年,提供表觀(guān)多組學(xué)完整解決方案;
每年服務(wù)100+海外和國內企業(yè)及200+高校和醫院等客戶(hù);
已經(jīng)完成人、動(dòng)植物等幾十個(gè)物種, 5000+例樣本項目;
嚴格m6A MeRIP建庫質(zhì)控和效率;
自動(dòng)化樣本處理、建庫及分析流程,保障高效周期,40天極速交付;
團隊已經(jīng)發(fā)表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章;
專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊, 提供更多個(gè)性化分析思路和方案
樣品類(lèi)型和要求
樣本類(lèi)型 | 樣本要求 |
Total RNA | 提供去蛋白并進(jìn)行DNase處理后的完整Total RNA,樣本總量不小于20 ug,樣品濃度不低于100 ng/uL。 |
培養細胞 | 提供不少于1x10*7個(gè)細胞,收集貼壁或者懸浮細胞、用PBS(RNase-free)洗滌1次,加入1mL Trizol反復吹打細胞至看不見(jiàn)成團的細胞塊,整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài);液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸。 |
新鮮動(dòng)物組織 | 提供切成1cm2左右的組織塊,不少于2g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸;皮膚、骨、結締組織、脂肪等特殊組織建議送備份 |
新鮮植物組織 | 提供切成1cm2左右的組織塊,不少于5g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸 |
其他類(lèi)型樣本 | 咨詢(xún)技術(shù)支持 |
備注:用封口膜密封樣品; 干冰運輸;送樣前備注好物種、部位、保存時(shí)間 |
數據信息分析
DRS | 分析內容 | 備注 |
標準分析 | 1、測序數據質(zhì)量評估 | 過(guò)濾掉低質(zhì)量數據,保證數據質(zhì)量 |
2、參考序列比對分析 | 比對率和覆蓋度分析 | |
3、m6A Peak Calling | 鑒定具有m6A修飾的區域 | |
4、m6A Peak motif | m6A修飾區域的序列偏好性 | |
5、m6A Peak圖譜分布 | m6A修飾在轉錄組上的分布 | |
6、差異m6A Peak分析 | 分析不同樣本間差異Peak峰 | |
7、差異m6A Peak富集 | 差異Peak峰的GO富集、KEGG富集分析 | |
高級分析 | 8、多組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析 | 與基因組,轉錄組,代謝組等數據關(guān)聯(lián)分析 |
9、關(guān)聯(lián)臨床信息分析 | 結合樣本臨床信息進(jìn)行統計分析挖掘 | |
10、其它定制化分析 | 結合課題背景亮點(diǎn)挖掘 |
案例1 去甲基化酶ALKBH5通過(guò)PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌的侵襲
Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer 21, 34 (2022) (IF=41.44)
研究方案:胃癌是嚴重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。胃癌轉移是癌癥治療失敗的主要原因之一,但N6 -甲基腺苷(m6A)與胃癌轉移的相關(guān)性報道較少。本研究采用Merip-seq檢測胃癌組織和正常組織(各三個(gè)重復)中的m6A修飾變化,qRT-PCR和IHC檢測ALKBH5在胃癌組織和細胞系中的表達,聯(lián)合RNA-seq和MeRIP-qRT-PCR技術(shù)篩選ALKBH5靶基因,后使用RNA Pull Down、質(zhì)譜法和Merip-seq篩選靶基因的“reader調控蛋白”。
研究亮點(diǎn):關(guān)聯(lián)m6A和基因表達,鑒定ALKBH5靶基因及靶基因的調控蛋白
研究結果:1.胃癌組織中檢測到ALKBH5表達降低,去甲基酶ALKBH5干擾促進(jìn)胃癌細胞轉移。2.鑒定PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點(diǎn),促進(jìn)了GC的侵襲和遷移。3.由ALKBH5敲低或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調表明ALKBH5以m6a依賴(lài)的方式調節PKMYT1的表達。4.IGF2BP3通過(guò)其m6A修飾位點(diǎn)幫助穩定PKMYT1的mRNA穩定性
圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細胞粘附相關(guān),ALKBH5與胃癌預后相關(guān)
案例2 番茄果實(shí)膨脹過(guò)程中mRNA m6A甲基組的獨特特征
Unique features of mRNA m6 A methylomes during expansion of tomato (Solanum lycopersicum) fruits
研究方案:盡管m6A在胚胎發(fā)育、花期控制、小孢子產(chǎn)生、果實(shí)成熟和逆境響應等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,但其在植物發(fā)育其他方面的作用仍有待探索。該研究通過(guò)平行的m6A免疫沉淀測序(m6A-seq)和RNA-seq分析,揭示了m6 A沉積與番茄果實(shí)膨脹之間的潛在聯(lián)系,鑒定番茄果實(shí)從未成熟綠期向成熟綠期擴展的過(guò)程中的m6A水平和基因表達之間的關(guān)系。
研究亮點(diǎn):多組學(xué)聯(lián)合分析,兩種抑制劑處理,關(guān)聯(lián)表型
研究結果:1.開(kāi)花后12,20,28天的番茄果實(shí)中全RNA和mRNA的m6A甲基化程度的逐步提升,分別檢測到15720、16547和16381個(gè)m6A Peak。2.大量參與生長(cháng)素和赤霉素信號傳導基因,以及一些與細胞擴增和果皮厚度相關(guān)的基因都含有m6A修飾。3.m6A甲基化轉移酶抑制劑DA的注射降低m6A水平,加速果實(shí)成熟;去甲基化酶抑制劑MA的注射則延緩果實(shí)成熟。
圖二 直接注射m6A轉移酶抑制劑或去甲基化酶抑制劑對番茄果實(shí)發(fā)育的影響
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 為什么MeRIP-seq需要測兩個(gè)樣本(Input和IP)?
常規m6A MeRIP-seq中Input和IP構成一對組合。IP樣品使用m6A抗體特異性富集具有甲基化修飾的RNA,而Input則是僅含有RNA的對照,通過(guò)消除背景噪音和峰值PEAK計算,將兩個(gè)樣本不同m6A區域計算出來(lái)。
2. MeRIP-seq后續的實(shí)驗怎么安排?
在利用MeRIP-seq得到m6A甲基化差異基因后,下一步可以通過(guò)MeRIP-qPCR直接對該基因進(jìn)行驗證。也可以通過(guò)關(guān)聯(lián)多組學(xué)(比如RNA-seq)分析基因表達和m6A修飾的變化,從多方面挖掘分析內容。
N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉錄組修飾之一,在幾乎所有生命的細胞RNA中都有發(fā)現,普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區域中。m6A功能非常豐富,包括調節RNA的剪接、核輸出、穩定性和翻譯來(lái)影響RNA的命運和表達,也因此成為近年來(lái)國內外的研究熱點(diǎn),國自然的研究數目屢屢攀高。為了滿(mǎn)足廣大科研工作者的需求,艾斯基因推出微量以及常量m6A甲基化免疫沉淀測序(m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing,m6A MeRIP-seq),在全基因組范圍內鑒定具有m6A修飾的區域。其原理為通過(guò)特異識別m6A修飾的抗體,對細胞內具有m6A修飾的RNA?段進(jìn)?免疫共沉淀。對沉淀下來(lái)的RNA?段進(jìn)??通量測序,結合?物信息學(xué)分析,對樣本m6A修飾進(jìn)?系統研究。MeRIP-seq是?前研究m6A修飾使?較普遍的技術(shù)之?。
重要技術(shù)質(zhì)控,用心服務(wù)每一個(gè)項目
艾斯團隊專(zhuān)注表觀(guān)組學(xué)12年,提供表觀(guān)多組學(xué)完整解決方案;
每年服務(wù)100+海外和國內企業(yè)及200+高校和醫院等客戶(hù);
已經(jīng)完成人、動(dòng)植物等幾十個(gè)物種, 5000+例樣本項目;
嚴格m6A MeRIP建庫質(zhì)控和效率;
自動(dòng)化樣本處理、建庫及分析流程,保障高效周期,40天極速交付;
團隊已經(jīng)發(fā)表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章;
專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊, 提供更多個(gè)性化分析思路和方案
樣品類(lèi)型和要求
樣本類(lèi)型 | 樣本要求 |
Total RNA | 提供去蛋白并進(jìn)行DNase處理后的完整Total RNA,樣本總量不小于20 ug,樣品濃度不低于100 ng/uL。 |
培養細胞 | 提供不少于1x10*7個(gè)細胞,收集貼壁或者懸浮細胞、用PBS(RNase-free)洗滌1次,加入1mL Trizol反復吹打細胞至看不見(jiàn)成團的細胞塊,整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài);液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸。 |
新鮮動(dòng)物組織 | 提供切成1cm2左右的組織塊,不少于2g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸;皮膚、骨、結締組織、脂肪等特殊組織建議送備份 |
新鮮植物組織 | 提供切成1cm2左右的組織塊,不少于5g;將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好,迅速置于液氮中速凍,-80℃保存,干冰運輸 |
其他類(lèi)型樣本 | 咨詢(xún)技術(shù)支持 |
備注:用封口膜密封樣品; 干冰運輸;送樣前備注好物種、部位、保存時(shí)間 |
數據信息分析
DRS | 分析內容 | 備注 |
標準分析 | 1、測序數據質(zhì)量評估 | 過(guò)濾掉低質(zhì)量數據,保證數據質(zhì)量 |
2、參考序列比對分析 | 比對率和覆蓋度分析 | |
3、m6A Peak Calling | 鑒定具有m6A修飾的區域 | |
4、m6A Peak motif | m6A修飾區域的序列偏好性 | |
5、m6A Peak圖譜分布 | m6A修飾在轉錄組上的分布 | |
6、差異m6A Peak分析 | 分析不同樣本間差異Peak峰 | |
7、差異m6A Peak富集 | 差異Peak峰的GO富集、KEGG富集分析 | |
高級分析 | 8、多組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析 | 與基因組,轉錄組,代謝組等數據關(guān)聯(lián)分析 |
9、關(guān)聯(lián)臨床信息分析 | 結合樣本臨床信息進(jìn)行統計分析挖掘 | |
10、其它定制化分析 | 結合課題背景亮點(diǎn)挖掘 |
案例1 去甲基化酶ALKBH5通過(guò)PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌的侵襲
Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer 21, 34 (2022) (IF=41.44)
研究方案:胃癌是嚴重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。胃癌轉移是癌癥治療失敗的主要原因之一,但N6 -甲基腺苷(m6A)與胃癌轉移的相關(guān)性報道較少。本研究采用Merip-seq檢測胃癌組織和正常組織(各三個(gè)重復)中的m6A修飾變化,qRT-PCR和IHC檢測ALKBH5在胃癌組織和細胞系中的表達,聯(lián)合RNA-seq和MeRIP-qRT-PCR技術(shù)篩選ALKBH5靶基因,后使用RNA Pull Down、質(zhì)譜法和Merip-seq篩選靶基因的“reader調控蛋白”。
研究亮點(diǎn):關(guān)聯(lián)m6A和基因表達,鑒定ALKBH5靶基因及靶基因的調控蛋白
研究結果:1.胃癌組織中檢測到ALKBH5表達降低,去甲基酶ALKBH5干擾促進(jìn)胃癌細胞轉移。2.鑒定PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點(diǎn),促進(jìn)了GC的侵襲和遷移。3.由ALKBH5敲低或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調表明ALKBH5以m6a依賴(lài)的方式調節PKMYT1的表達。4.IGF2BP3通過(guò)其m6A修飾位點(diǎn)幫助穩定PKMYT1的mRNA穩定性
圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細胞粘附相關(guān),ALKBH5與胃癌預后相關(guān)
案例2 番茄果實(shí)膨脹過(guò)程中mRNA m6A甲基組的獨特特征
Unique features of mRNA m6 A methylomes during expansion of tomato (Solanum lycopersicum) fruits
研究方案:盡管m6A在胚胎發(fā)育、花期控制、小孢子產(chǎn)生、果實(shí)成熟和逆境響應等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,但其在植物發(fā)育其他方面的作用仍有待探索。該研究通過(guò)平行的m6A免疫沉淀測序(m6A-seq)和RNA-seq分析,揭示了m6 A沉積與番茄果實(shí)膨脹之間的潛在聯(lián)系,鑒定番茄果實(shí)從未成熟綠期向成熟綠期擴展的過(guò)程中的m6A水平和基因表達之間的關(guān)系。
研究亮點(diǎn):多組學(xué)聯(lián)合分析,兩種抑制劑處理,關(guān)聯(lián)表型
研究結果:1.開(kāi)花后12,20,28天的番茄果實(shí)中全RNA和mRNA的m6A甲基化程度的逐步提升,分別檢測到15720、16547和16381個(gè)m6A Peak。2.大量參與生長(cháng)素和赤霉素信號傳導基因,以及一些與細胞擴增和果皮厚度相關(guān)的基因都含有m6A修飾。3.m6A甲基化轉移酶抑制劑DA的注射降低m6A水平,加速果實(shí)成熟;去甲基化酶抑制劑MA的注射則延緩果實(shí)成熟。
圖二 直接注射m6A轉移酶抑制劑或去甲基化酶抑制劑對番茄果實(shí)發(fā)育的影響
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 為什么MeRIP-seq需要測兩個(gè)樣本(Input和IP)?
常規m6A MeRIP-seq中Input和IP構成一對組合。IP樣品使用m6A抗體特異性富集具有甲基化修飾的RNA,而Input則是僅含有RNA的對照,通過(guò)消除背景噪音和峰值PEAK計算,將兩個(gè)樣本不同m6A區域計算出來(lái)。
2. MeRIP-seq后續的實(shí)驗怎么安排?
在利用MeRIP-seq得到m6A甲基化差異基因后,下一步可以通過(guò)MeRIP-qPCR直接對該基因進(jìn)行驗證。也可以通過(guò)關(guān)聯(lián)多組學(xué)(比如RNA-seq)分析基因表達和m6A修飾的變化,從多方面挖掘分析內容。
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